熱原是微生物的代謝產(chǎn)物,是微生物的一種內(nèi)毒素,其主要成分是脂多糖,分子量一般為106左右。
　　
　　去除熱原的主要方法有:
　　
　　1高溫法。多在250℃加熱30分鐘以上。
　　
　　2酸堿法。用酸或堿進行處理,破壞熱原。
　　
　　3吸附法。常用011%～015%的活性炭吸附處理。
　　
　　4層析法。利用離子交換樹脂或分子篩凝膠層析處理。
　　
　　5超濾法。使用超濾裝置濾除熱原物質(zhì)。
　　
　　為了保證熱原符合規(guī)定,往往要經(jīng)過多次實驗才能選擇合適的方法,設(shè)計出適宜的工藝路線。在實際產(chǎn)品試制過程中,由于生化藥物及基因工程藥物多為核酸(核苷酸)類和蛋白質(zhì)(肽、氨基酸)類物質(zhì),是微生物生長的優(yōu)良培養(yǎng)基,控制熱原成為一個生產(chǎn)難點。
　　
　　控制熱原可以從以下多個方面綜合考慮:
　　
　　1在生產(chǎn)全過程中注意控制熱原的整體水平
　　
　　避免在過程中受到微生物污染可避免引入過多的熱原物質(zhì)。所有的去除熱原的方法都是基于熱原物質(zhì)在一定水平下,如果熱原污染嚴重,處理起來就相當(dāng)困難。
　　
　　藥品生產(chǎn)的GMP管理,有效地加強了在生產(chǎn)全過程中對熱原的控制。生產(chǎn)環(huán)境潔凈度的控制、物料存放時溫度的控制等,現(xiàn)在生產(chǎn)過程中已能嚴格執(zhí)行,而對于時間的控制則往往忽視了。在潔凈百級的環(huán)境下,環(huán)境溫度一般要求在18～26℃,沉降菌允許3個P皿(30分鐘)。在此溫度下,蛋白質(zhì)、核酸類物質(zhì)有利于微生物的繁殖,也就是說本已是無菌的原料或上一工序已無菌處理的物料,可能出現(xiàn)微生物的生長。因此根據(jù)長期的生產(chǎn)經(jīng)驗,要求物料(液)在處理完畢后進行除菌過濾,而且從物料打開包裝進行處理、配制到進行除菌過濾,時間宜控制在3小時內(nèi),如處理后仍需冷藏的物料,則處理過程最好控制在2小時內(nèi)。
　　
　　2用具處理
　　
　　一般教科書中所提供的方法對于已洗干凈的物品均是適用的。而對于已污染微生物或久置未用的用具則需給予特別注意。即在清洗過程中,先使用一定的化學(xué)方法進行除熱原處理。如用洗液浸泡15分鐘以上或1%氫氧化鈉溶液煮沸15分鐘(建議
　　
　　不使用碳酸鈉),處理完畢后用無熱原水進行清洗。
　　
　　3選擇去除原料、中間品中熱原的方法
　　
　　對于可能含有熱原的原料或中間品,去除熱原的方法受到多方面的限制。過酸、過堿、過熱都會導(dǎo)致失活、降解、變性;吸附、超濾則導(dǎo)致含量損失、活性下降。常用的方法主要有凝膠過濾法、超濾法、吸附法。
　　
　　3.1凝膠過濾法
　　
　　對于處理量少的樣品(如幾十毫升),在實驗室
　　
　　條件下,該法較為適用?？筛鶕?jù)分子量和化學(xué)性質(zhì)
　　
　　選擇凝膠(如SephadexG75),凝膠在裝柱前煮沸滅菌或用稀酸、稀堿洗滌,配制洗脫液的鹽可用高溫法除去熱原,配液用無熱原水(溶劑),洗脫液容器的通氣口用無菌脫脂棉封口,當(dāng)用鱟試驗法檢查層析柱平衡液的流出液內(nèi)毒素反應(yīng)呈陰性時,方可進行凝
　　
　　膠過濾,過程中溫度宜控制在10℃以下,過濾時間控制在3小時內(nèi),并根據(jù)過濾時間來確定柱體積與上樣量。曾測試層析時間為4小時的蛋白質(zhì)類物質(zhì)除熱原,熱原符合規(guī)定。
　　
　　3.2超濾法
　　
　　目前生產(chǎn)上已廣泛使用超濾法去除熱原,超濾膜截留孔徑多選用7000～30000分子量之間,效果較為令人滿意。超濾裝置與超濾膜的完整性是該法的關(guān)鍵。超濾前對樣品進行預(yù)過濾以及超濾后即時進行清洗,可延長超濾膜的使用壽命。
　　
　　對于組份復(fù)雜的蛋白質(zhì)、肽類物質(zhì),超濾后,將發(fā)生一些變化。對于液態(tài)制成品,在貯存期內(nèi),可能會緩慢出現(xiàn)微量沉淀、白點、白塊;對于固態(tài)制成品,則可能在溶解時存在微量不溶或白點、白塊,從而導(dǎo)致澄明度不合格,這需在工藝中另行克服解決?？赡艿脑蚴?超濾前的物質(zhì)的穩(wěn)態(tài)系統(tǒng),在超濾過程中部分物質(zhì)被除去或是除去的比例不同,致使平衡破壞,造成另一部分物質(zhì)析出而達到新的平衡。
　　
　　超濾時還需注意的是pH。濾出液的pH差值可能變化012甚至015。另外,待超濾液的pH不僅對超濾速度產(chǎn)生影響,還直接影響到產(chǎn)品收率、活性。
　　
　　3.3吸附法
　　
　　吸附劑以活性碳最為常用,且成本低廉?；钚蕴嘉教幚頍嵩瓡r的關(guān)鍵在于控制pH與溫度?；钚蕴嫉挠昧繛?11%～015%,一般不必超過014%,用量較大時可分次加入。在使用前,將活性碳在180℃烘烤2小時,一方面使活性碳本身去除熱原,另一方面也使得活性碳活化,提高吸附力,使一定工藝條件下吸附力穩(wěn)定。
　　
　　活性碳吸附處理時,料液的pH應(yīng)控制在酸性條件下,此時去除熱原的效果比較理想?？紤]到對產(chǎn)品性質(zhì)的影響,一般選擇pH510～615。如料液終
　　
　　點pH>615,在活性碳吸附處理前,先將pH調(diào)到pH615以下;吸附處理后,去除活性碳,然后再回調(diào)pH至終點pH。如在去除活性碳前就回調(diào)pH至終點pH,則可能使已吸附的熱原物質(zhì)發(fā)生解吸附,從
　　
　　而使熱原不合格。
　　
　　活性碳吸附處理時的料液溫度對吸附效果影響也十分重要。如pH610、40℃吸附處理20分鐘熱原不合格的核酸類料液,于pH610、80℃吸附處理20分鐘,熱原可符合規(guī)定。如果料液性質(zhì)允許,吸附處理的溫度可盡量提高,相應(yīng)的可縮短處理時間;如不宜高溫處理,則可降低吸附處理時的pH,并適當(dāng)延長吸附時間。
　　
　　通過pH、溫度與吸附時間、活性碳用量的相互配合,在除去的同時,可使含量損失控制在10%以內(nèi)。